בקרה על ביטוי גנים והנדסה גנטית

השיעור מציג את המנגנונים שבעזרתם תאים מפעילים ומפסיקים גנים, ואת העקרונות של העברת גנים בהנדסה גנטית. הרעיון המרכזי הוא שרצף DNA זהה יכול להוביל לתפקודים שונים, משום שביטוי הגנים מפוקח, ושהיכולת לשלוט בביטוי זה מאפשרת גם להחדיר גנים ולבטא אותם ביצורים אחרים.

ביטוי גנים סלקטיבי ביצורים רב-תאיים

ביצורים רב-תאיים כל התאים נוצרים מתא מופרה יחיד בחלוקות מיטוזה, ולכן הם נושאים בדרך כלל מטען גנטי זהה. למרות זאת, תא עצב, תא שריר ותא דם לבן נבדלים זה מזה במבנה, בתפקוד ובחלבונים שהם מייצרים. ההבדלים אינם נובעים משינוי ברצף ה-DNA, אלא מביטוי סלקטיבי של גנים: בכל תא מופעלים גנים מסוימים ומושתקים גנים אחרים, בהתאם לתפקיד התא, לשלב ההתפתחות ולתנאי הסביבה.

• גנים של תחזוקה שוטפת (Housekeeping genes): גנים המתבטאים באופן קבוע בכל תאי האורגניזם. הם מקודדים לחלבונים החיוניים לתהליכי יסוד, כגון נשימה תאית, שכפול DNA, תעתוק ובניית דופן התא.
• גנים ייחודיים לתא או לרקמה: גנים המתבטאים רק בסוגי תאים מסוימים או בשלבי התפתחות מוגדרים. דוגמה לכך היא גנים הקשורים לפוטוסינתזה או לייצור כלורופיל, המתבטאים בתאי צמח ירוקים בלבד, ולא בתאי שורש.

בקרה על ביטוי גנים בחיידקים: אופרון הלקטוז

בחיידקים, גנים המשתתפים לעיתים במסלול מטבולי אחד יכולים להיות מסודרים באופרון. אופרון הוא מקטע DNA הכולל כמה גנים מבניים המתועתקים יחד למולקולת mRNA אחת, ונשלטים על ידי אזור בקרה משותף. הדוגמה הנפוצה היא אופרון הלקטוז בחיידק E. coli, המאפשר לחיידק לייצר אנזימים לפירוק לקטוז רק כאשר הסוכר הזה נמצא בסביבה.

אזור הבקרה של האופרון כולל שני אתרים עיקריים:

• אתר מקדם (Promoter): רצף DNA שאליו נקשר RNA-פולימראז כדי להתחיל תעתוק של הגנים המבניים.
• אתר מפעיל (Operator): רצף DNA שאליו יכול להיקשר חלבון מדכא ולחסום את התעתוק.

הגן המקודד לחלבון המדכא נמצא מחוץ לאופרון ומבוטא באופן קבוע.

כאשר אין לקטוז בסביבה, המדכא קשור לאתר המפעיל וחוסם פיזית את התקדמות RNA-פולימראז, ולכן הגנים המבניים אינם מתועתקים. כאשר יש לקטוז, מולקולת לקטוז נקשרת למדכא ומשנה את מבנהו, והוא מתנתק מהמפעיל. במצב זה האנזים יכול לנוע לאורך ה-DNA ולתעתק את הגנים הדרושים לפירוק הלקטוז.

רמת התעתוק מושפעת גם מנוכחות גלוקוז, משום שגלוקוז הוא מקור פחמן מועדף לחיידק:

• אין גלוקוז: ריכוז cAMP עולה, והוא נקשר לחלבון CAP. התצמיד cAMP-CAP נקשר לאתר המקדם ומחזק את קישור RNA-פולימראז, ולכן התעתוק גבוה.
• יש גלוקוז: ריכוז cAMP נמוך, התצמיד אינו נוצר, וקישור האנזים למקדם נשאר חלש. לכן התעתוק נמוך גם אם הלקטוז נמצא.

מכאן נגזרים שלושה מצבים עיקריים:

• מצע המכיל לקטוז בלבד: המדכא מנותק ויש הגברה באמצעות CAP, ולכן מתקבל תעתוק מרבי.
• מצע המכיל גלוקוז בלבד: המדכא קשור למפעיל, ולכן התעתוק מזערי או אפסי.
• מצע המכיל לקטוז וגלוקוז: המדכא מנותק, אך אין הגברת CAP, ולכן התעתוק נמוך.

הנדסה גנטית: עקרונות וכלים

הנדסה גנטית היא מערכת שיטות לבידוד, שינוי והחדרה של גנים מיצור אחד ליצור אחר. המטרה היא להביא לביטוי של גן מבוקש בתא מאכסן, למשל ייצור חלבון רצוי בחיידקים או הקניית תכונה לצמח.

כדי לבצע זאת משתמשים בכלים אחדים:

• אנזימי הגבלה: אנזימים המזהים רצף DNA ספציפי וחותכים את ה-DNA באתר זה. החיתוך יוצר לעיתים קצוות דביקים, כלומר קצוות חד-גדיליים בולטים. חיתוך הגן המבוקש והפלסמיד באותו אנזים יוצר קצוות משלימים ומאפשר חיבור ביניהם.
• DNA ליגאז: אנזים המחבר את שלד הסוכר-זרחה של מקטעי DNA שהוצמדו זה לזה, ויוצר מולקולת DNA רציפה.
• פלסמיד כנשא: פלסמיד הוא מולקולת DNA טבעתית קטנה הנמצאת מחוץ לכרומוזום החיידקי. הוא משמש נשא להחדרת הגן הזר לתא המאכסן.

רכיבי פלסמיד מהונדס

פלסמיד מהונדס הוא פלסמיד שהוכנס אליו גן מבוקש. כדי שהגן יתבטא בתא המאכסן, הפלסמיד כולל רכיבים אחדים:

• אזור בקרה להתחלת תעתוק: רצף הדרוש לקישור מנגנון התעתוק ולהפעלת הגן בתא המאכסן.
• גן מקודד למוצר: הרצף שממנו נוצר החלבון או המוצר הרצוי. למשל, גן המקודד לרעלן Bt, הפוגע בחרקים מזיקים לצמחים.
• גן ממיין או בורר: גן המאפשר לזהות ולברור תאים שקלטו את הפלסמיד, למשל גן המקנה עמידות לאנטיביוטיקה.

הגן הממיין אינו דרוש ליצירת המוצר עצמו. תפקידו לאפשר ברירה של תאים שקלטו את הפלסמיד, ולכן הוא חיוני לשלב הסינון אך לא לביטוי הישיר של גן המטרה.

הבחנה בין שינוי בתאי גוף לשינוי בתאי מין

שינוי גנטי יכול להתבצע בתאי גוף או בתאי מין. שינוי בתאי גוף, כלומר בתאים סומטיים, משפיע על הפרט המטופל בלבד ואינו עובר לצאצאים. לעומת זאת, שינוי בתאי מין, בגמטות או בתא מופרה, צפוי להופיע בכל תאי הצאצא ולעבור לדורות הבאים.

יצירת cDNA באמצעות תעתוק במהופך

בתאים אאוקריוטיים גנים רבים מכילים אינטרונים, שהם מקטעים שאינם מקודדים לחלבון, ואקסונים, שהם המקטעים המקודדים. לאחר התעתוק נוצר mRNA ראשוני, והוא עובר שחבור: האינטרונים נחתכים והאקסונים מתחברים ל-mRNA בוגר. לחיידקים אין מנגנון שחבור, ולכן גן אאוקריוטי שהוחדר אליהם ישירות מה-DNA הגרעיני עלול להתבטא באופן שגוי.

כדי להתגבר על כך משתמשים באנזים מתעתק במהופך, שמקורו בנגיפים שהחומר התורשתי שלהם הוא RNA. האנזים בונה גדיל DNA משלים, המסומן cDNA, על פי מולקולת mRNA בוגרת שכבר עברה שחבור. ה-cDNA מכיל רק את הרצף המקודד, ולכן הוא יכול להתבטא בתא חיידקי ולייצר את החלבון התקין.

הגברת מקטע DNA בשיטת PCR

שיטת PCR מאפשרת להגביר כמות קטנה של מקטע DNA ספציפי במבחנה, ללא צורך בתא חי. התהליך מתבצע במחזורים, ובכל מחזור מתרחשים שלושה שלבים:

1. דנטורציה: חימום לטמפרטורה גבוהה, כ-95°C, מפריד את ה-DNA הדו-גדילי לשני גדילים בודדים.
2. היצמדות פריימרים: קירור לטמפרטורה נמוכה יותר, כ-55°C, מאפשר לפריימרים, שהם מקטעי DNA קצרים, להיקשר באופן משלים לקצוות המקטע המבוקש.
3. הארכה: בטמפרטורה של כ-72°C, האנזים DNA-פולימראז עמיד לחום בונה גדיל חדש ומשלים החל מהפריימרים.

בתום מחזורים אחדים מתקבלת כמות גדולה של המקטע המבוקש, שאפשר להשתמש בה לבדיקות נוספות או לשיבוט בפלסמיד.